Projekt 5

1. Projektleiter

2. Thema

Identifikation und “molecular targeting” von Signalwegen


3. Zusammenfassende Projektbeschreibung

Basierend auf unseren bisherigen funktionellen Genom- und Proteomanalysen beim malignen Melanom sollen im vorliegenden Projekt mithilfe eines siRNA Screeningverfahrens Signalwege in Melanomzellen identifiziert werden, die für die Metastasierung von Bedeutung sind. Dazu sollen jeweils nicht metastasierende und metastasierende Melanomzellen mit einer gepoolten lentiviralen siRNA Library infiziert werden. Eine solche Library steht im Labor des Antragstellers zur Verfügung. Sie umfasst 3-4 siRNAs pro Gen für 47.500 Gene. Diese Untersuchungen erfolgen in Zusammenarbeit mit der AG Experimentelle Gentherapie der Universität Rostock. Zellen, in denen wichtige Signalwege ausgeschaltet werden, wachsen langsamer oder sterben sogar ab, wodurch es zu einem Verlust oder einer relativen Verringerung der jeweiligen siRNA kommt. Dieser Unterschied kann durch DNA Chip Hybridisierung der extrahierten DNA (mit integrierter siRNA) auf kommerzielle Affymetrix DNA Chips nach spezifischer PCR Amplifikation der siRNAs nachgewiesen werden. Mithilfe moderner Methoden der Bioinformatik können dann Signalwege und Proteinnetzwerke identifiziert werden. In nachfolgenden Verifizierungsuntersuchungen sollen einzelne siRNAs hinsichtlich ihres Einflusses auf Proliferation und Apoptose weiterer Melanomzelllinien getestet werden. Hierzu werden siRNAs eines kommerziellen Anbieters eingesetzt, der kleine „custom-made“ Panels lentiviraler siRNA Konstrukte für gezielte Screens anbietet. Darüber hinaus sollen Gesamtproteome von Melanomzellen vor und nach siRNA Transfektion einzelner herausragender siRNA Moleküle erstellt werden, um die an der Wirkung der betroffenen Gene beteiligten, downstream befindlichen Proteine zu identifizieren.

In einem abschließenden Versuchsansatz soll mit den so identifizierten Signalwegen gezielt mittels small molecule inhibitors interferiert werden. Hierzu soll einerseits auf kommerzielle verfügbare small molecules zurückgegriffen werden, die für eine Reihe von Signalmolekülen bereits verfügbar sind. Andererseits sollen in Zusammenarbeit mit Arbeitsgruppen an der Universität Rostock, die auf die Synthese kleiner Inhibitormoleküle spezialisiert sind, spezifische neue Moleküle synthetisiert und getestet werden. Ziel ist es dabei, gezielt in wichtige Signalwege der Melanomprogression einzugreifen, ohne benigne Zellen oder zelluläre Prozesse, die für alle Zellen des Organismus von Bedeutung sind zu beeinträchtigen.

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